※生物工程良品科学2008,V01．29,No．09373中温仪一淀粉酶的酶学性质研究刘洋，沈微，石贵阳，王正祥·(江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡 214122)M23产生的伍·淀粉酶进行了纯化，摘要：通过盐析、DEAE．FF和．75，对ciens1．199／L·rain。薄层层析结果表明该酶水解淀粉生成糊精和寡聚糖。关键词：ciens；a．淀粉酶；纯化；性质philic伐一，SHIYang，SHENGui·yang，-xiang·( ，，，，China) bstract：a-．amyloli自ity．．Its from5．5to6．5．andthe is60℃．-amylase from7．0to room10．0．％ pHrange ℃．止the ththe ／LCa2+．啦zymeC02+．1(Ⅲand ．33 and1．，while，Ca2+，Mn2+andV—ofa—／Lg／L。
．rain，． s：中图分类号：Q55文献标识码：A3．2．1．1)以糖源或淀粉为底物，从分子 1a．淀粉酶(EC材料与方法 内部切开a．1．4糖苷键而使底物水解，产生糊精、寡糖、 麦芽糖、葡萄糖等产物。它是一种非常重要的工业用1．1 材料与试剂M23保存于中国高校工业 酶，广泛应用于食品、纺织、造纸、洗涤、医药等菌种B． 工业【l-，】。在不同工业中，需要应用不同酶学性质的a． 淀粉酶。酒精工业需要高温酸性伍一淀粉酶：纺织、造菌种保藏编号。摇瓶发酵培养基组成为： 纸工业需要中温a．淀粉酶；洗涤工业需要碱性ot．淀粉 酶。产生a．淀粉酶的微生物种类很多，有细菌，真菌 来源，不同种属微生物所产生的0‘一淀粉酶性质也有所差 异问。相对于其他淀粉水解酶，来源于R国产分析纯。 的中温淀粉酶，一直未得到深入研究。本研究对曰．1．2 仪器DEAE·美M23a一淀粉酶的进行了纯化和酶学性AKTA．、一75 质研究。
国惠普公司。 收稿日期：2007．09．21 基金项目：新世纪优秀人才支撑计划项目(NCET．04．0497)：国家“863”项目() ·通讯作者：王正祥(1964一)，男，教授，博士，研究方向为工业微生物资源与育种，分子微生物学。E-mail：zxwang@．edu．cn 万方数据 3742008．V01．29．No．09食品科学※，E物工程 1．3 a一淀粉酶的分离纯化将酶液分别用pH3．0～6。0柠檬酸柠檬酸钠缓冲液，全部操作均在室温进行。发酵液6000r／rain离心Tis．HCI缓pH6．O～8．0磷酸氢二钠．柠檬酸，pH8．O～9．0 10min去菌体，所得上清液为粗酶液。粗酶液进行80％冲液，pH9．5～lO．5硼酸．氢氧化钠缓冲液稀释，按标准方法测酶活力，以酶活最高者为100％。用相同的缓 饱和的硫酸铵盐析沉淀，8000r／min离心30min，沉淀经冲液稀释，25℃保温24h后，测残余酶相对活力，以 去离子水透析，冻干后，用3ml柠檬酸一磷酸氢二钠(pH6． O)缓冲液溶解后，上DEAE．Fast未保温的酶液的酶活为100％。
Flow阴离子交换柱(16 mill×100mm)，基础缓冲液为20mmol／LTris．HCI(pH1．7．4 金属离子和化学试剂对酶活力影响 8．6)，用含O～lmol／LNaCl的基础缓冲液进行线形洗脱， 洗脱速度为2ml／min，收集合并酶活峰后，上预先经与l％淀粉溶液等体积混合，作为底物。各自加入淀粉 20mmol／LTris—HCl(pH6．5)缓冲液平衡好的-75层酶液，测定酶相对活力，以只含淀粉底物的正常条件 析柱(26mm×600mml进行洗脱，洗脱速度2ml／min，收下测定酶液的活力为100％。 集合并酶活峰，经去离子水透析，冻干，用于酶学性1．7．5 动力学常数测定 质研究。在不同底物(可溶性淀粉)浓度的反应体系中， 1．4 酶活力测定麦芽糖标准曲线的绘制：配置浓度为O、l、2、．Burk双倒数图。 3、4、5pmol／L的麦芽糖溶液，各取lml，60℃保温1．7．6 酶水解产物的硅胶板薄层层析 5rain，加入lmlDNS试剂，沸水浴5min，蒸馏水稀释参考文献【8】的方法，展开剂为正丁醇：乙酸：水=2：l： 至l0ml，测AⅢ。
以麦芽糖浓度为横坐标、吸光度为1，上行展开两次。显色剂为49二苯胺和4ml苯胺溶于 纵坐标绘制标准曲线。200ml丙酮和20ml85％磷酸的混合液。硅胶板浸泡显色剂酶活力测定在20ml试管中依次加入0．9ml1％可溶性后，在烤箱中90℃烘10～15min可见层析结果。 淀粉溶液(NaH2P04．柠檬酸缓冲液pH6．0配置)，60℃预 热5min，再加入0．1ml酶液，60℃保温5min后，加入2 结果与分析 lmlDNS试剂，沸水浴5rain，蒸馏水稀释至10ml，测 As40。与麦芽糖标准曲线对照得反应液麦芽糖浓度，计 2．1酶的分离纯化 算酶活力。粗酶液经过盐析、DEAE—Fast凝胶过滤层析等纯化步骤后，最终酶的比活提高了29．96酶活力单位定义：在pH6．0、温度60。C，5min水倍，酶活回收率为20．06％。将酶蛋白样品进行SDS— 解可溶性淀粉释放lmol还原物质(以麦芽糖计算)时所需 的酶量，为1个酶活力单位(U)。PAGE凝胶电泳，表明为一条带，电泳结果见图1，以 1．5 蛋白含量测定上各步提纯结果列于表1。按方法测定【7】，以牛血清白蛋白绘制标准表1淀粉酶纯化总表 曲线。
Table1 【- 1．6 电泳分析SDS．PAGE电泳分析参照文献[8】，分离胶浓度为 12％。 1．7 酶学性质 1．7．1 分子量测定2．2 酶的基本性质用SDS．PAGE法测定酶的分子量，根据已知分子量 的标准蛋白在SDS—PAGE中的相对迁移率Rf，作Rglog2．2．1 分子量 Mr图，求得其分子量。M23 1．7．2 最适反应温度及热稳定性a一淀粉酶分子量约为58kD，电泳图见(图1)。在不同温度下按照标准方法测定酶活，以酶活最高2．2．2 酶的最适反应温度 者为100％。将酶液在55、60、70C，分别保温15、30、在不同温度下测定酶的活力，实验结果表明，曰． 45、60min，放置冰上迅速冷却至室温，按标准方法，测M23a一淀粉酶在30～c的温度范围 残余酶相对活力，以未保温的酶液的酶活为100％。内都有活力，最适反应温度为55℃，在40～70℃有较 1．7．3 酶的最适反应pH值及pH值稳定性高活力，70℃以上活力较低(图2)。 万方数据100霎∞80髓40蒌2000 15 30 45 60时间(alia)S蜉髓靛flow；4．盐析。
罂 1．蛋白质标准分子量；2．-75,3．DEAE．fast图1M23a-淀粉酶纯化后的B． 15 30 45 60SDS电泳图片时间(min)1 SDSofB．eda·-amylase★Ca2+浓度为5moVL--II-Ca2+浓度为10mol／LM23Of,-淀粉酶热稳定性的影响。d哪fo脚图3M23n一淀粉酶热稳定性的影响Ca2+对B． +．ciens^摹一船髓靛罂2．2．4 酶的最适反应pH值及pH值稳定性M230c一温度(℃)淀粉酶的最适反应pH值，结果表明该酶的的最适反应M23图2a-淀粉酶活性的影响温度对8．amy／o／． tyOf,·faciens 2．2．3 Ca2+对酶的热稳定性影响间比较稳定。
在反应体系中分别添加2、5、lOmmol／LCa2+，并 在不同温度(55、60、70℃)下保温。实验结果表明：M23嚣0c．淀粉 无Ca2+存在情况下，B．嚣 酶，在55℃下保温l5min，基本丧失活力，但在添加髓按 2、5mmol／L或lOmmol／LCa2+存在情况下，对酶的热稳霉 定性有很大提高，55℃保温60min，分别残留70％或85％ 以上活力(图3A)；酶液在60℃保温下，添加5mmoVL或 10nunol／LpHCa2+，酶液保温1h，分别残留60％或85％以M23图4 pH值对B．a删，fof『qu，acMnsa一淀粉酶活性的影响 上活力(图3B)．酶液在70℃保温时，添加10mmol／．of ．-amylase Ca2+，保温15min还残留50％活力，而添加5mmol／LM23amy／ Ca2+，酶液保温15rain，基本丧失活力(图3C)。说明Ca2+ 对酶的热稳定性影响很大，+能显著提高酶 的热稳定性。
100萝垂蹬茛罂萝80《60饕40罂20图5M23伍一淀粉酶的影响pH值对B．ectsof value0／1 15 30 45 60Fig．-amylase时间(珈Iin)M23amy／oliq『 万方数据 3762008，V01．29，No．09良品斛学※乍物丁程 2．2．5 金属离子和化学试剂对酶的活性的影响实验结果表明(表2)，10mmol／L的钙离子、锰离子、 钴离子对酶活有强烈激活作用；钠离子、锂离子对酶活 有部分促进作用；EDTA部分抑制淀粉酶的活性。钾离 子、镁离子、锌离子、铁离子对酶活影响不大。表2 不同金属离子对酶活力的影响 Table2 ．n-为系列标准糖混合物(Gl：葡萄糖；G2：麦芽糖；G3：麦芽三糖k2为葡萄糖；3为麦芽糖；4为淀粉：5为1h反应液：6为3h反应液；7为24h反应液。M23图7a一淀粉酶酶的水解终产物TLC分析8．romB．Fig．7 bya·／ 讨 论 2．2．6 a一淀粉酶的动力学常数以可溶性淀粉为底物，在pH6．0，温度60℃的条M23中纯化的a一淀粉酶的从B． 件下，取不同浓度的可溶性淀粉(S)，测得反应速度 最适温度在55℃，在40～70℃有比较高的活力，最适 (V)，得到1／V与1／【S】的关系曲线(图6)，该酶对可溶性 淀粉的Km，Vm-x，分别为4．339／L，1．199／L·rain。
活有较强的激活作用，EDTA对酶活有明显的抑制作用，与目前应用的BF一7658淀粉酶的酶学性质在最适作一@4．0用温度，pH值稳定性，对金属离子对酶活性影响方面口’苕 3．0一y2．0种属的q．淀粉酶的性质也有一定差异(表3)。》步而n。．_一0．4—0．20．0 0．2 0．4 0．6 0．8 1．O 1．2 对酶的热稳定性有较大的促进作用，与报道许多淀粉酶【S】4(Ug)都对Ca：+有一定依赖作用相一致，Ca2+缺失对一些淀粉M23图8 B．,-淀粉酶K．值测定酶酶活性及稳定性有重要影响【1I·13]。Ca2+有维持最适构-．6plota-象的作用；失去Ca2+能导致酶失活或对热、酸等变性B．amy／因素的稳定性降低【4】。该酶的最适反应pH值和酶的稳定 2．2．7 a．淀粉酶的水解产物分析的pH值不一致。这与孙俊良【14】报道结果一致，酶在维用0．2mol／L的柠檬酸．磷酸氢二钠缓冲液(pH6．01配制持最适反应时的构象与酶结构稳定构象所需的pH值不一 底物浓度为1．0％(w／v)的可溶性淀粉溶液，向4ml淀粉定相同。
底物中加入0．5ml酶液，混匀后，60℃保温反应不同的 在淀粉糖和纺织工业中需要添加一定量的中温淀粉酶 时间，分别取样用碘液和硅胶板薄层色谱的方法分析，进行液化和退浆，需要淀粉酶的最的作用温度在55～85 淀粉水解产物的薄层层析见(图7)，由图7看出淀粉在该 酶作用下，最终主要转化生成糊精和寡聚糖，表明该M23中纯化的a淀粉酶的酶学性质基本符合工业化过程 酶为内切酶。中对酶的要求，该酶比较适合应用于这两个工业。表3不同种属Bacil／us．sp氆一淀粉酶酶学性质比较 n—．eB． 万方数据M23产生的仅一1616．为进一步满足B．【刀 韦平和．生物化学实验与指导O旧．北京：中国医药科教出版社，2003． 淀粉酶对工业化生产的需求，提高B．【8】 赵永芳．生物化学技术原理及应用[M】．3版．北京：科学出版社，2007． M23Ct．淀粉酶的产量在进一步研究中。
【9】S，．D40UET．Prol(-otato -mnylase 参考文献：Environ【J】．Appl ，1988，54：1516．1522．MAMOG．九【10]-VANDER㈣LMJ．脒B。UITDEI-IAAGJC， --．鹤ch--帆．∞family【J】．，2002，94(2)：137-155．Tech,1999，25(3／5)：433-438．E【11】 CHAWS．YUK．sSⅣ。，(’-
