实验二实验器具的灭菌
一、实验目的
1.学习并初步掌握和各种实验器具的包扎及高压蒸汽灭菌的方法。
2.了解其他灭菌方法。
二、基本原理
高压蒸汽灭菌法可杀灭包括芽胞在内的所有微生物，是灭菌效果最好、应用最广的灭菌方法。其基本原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加，在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃，在此温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。
三、器材
1、高压蒸汽灭菌锅
2、牛皮纸
3、棉绳
4、仪器和其他用具
四、操作步骤
1、包扎
将各种实验器具进行合理规范包扎后，要用牛皮纸覆盖，最后用棉绳系紧。
2、加热烧开
待高压锅内的水烧开，将包扎好的器具放入锅内的桶内，最后放入高压锅。
3、升压
完全排除锅内空气后，关闭放弃阀，待压力上升到0.1MPa时，开始计时，维持压力0.1~0.15MPa 20分钟。
4、减压，取出器具
到达保压时间后，即可切断电源，压力降到0.5MPa时，可缓慢放出蒸汽，注意不要使压力降低太快，以致引起激烈的减压沸腾，使容器中的液体四溢。当压力降到零后，才能开盖。
五、思考题
（1）、你认为那些环节会影响高压灭菌的效果？如果影响，请简述其中最关节的环节是什麽？
实验三牛肉膏蛋白胨培养基的配制
—、目的要求
1、明确培养基的配制原理
2、通过对基础培养基的配制，掌握培植基的一般方法和步骤。
二、基本原理
牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：
牛肉膏 3.0g
蛋白胨10.0g
NaCI 5.0g
水
pH 7.4～7.6
三、器材
1、溶液和试剂牛肉膏，蛋白胨，NaCI,琼脂，1 moI/L NaOH, 1 moI/L HCI。
2、仪器和其他用品试管，三角瓶，烧杯，量筒，破棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸气灭菌锅，pH试纸（pH5.5～9.0），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。
四、操作步骤
1、称量
按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨，NaCI放入烧杯中。牛肉膏常用破棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水融化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时，如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。
（蛋白质很易吸湿，在称取时动作要迅速，另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。瓶盖也不要盖错。）
2、溶化
在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，或在磁力搅拌器上加热溶解。将药品完全溶解后，补充水到所需的总体积，如果配制固体培养基时，将称好的琼脂放入已溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。在制备用三角瓶盛固体培养基时，一般也可先将一定量的液体培养基分装于三角瓶中，然后按1.5％~2.0％的量将琼脂直接分别加入各三角瓶中，不必加热溶化，而是灭菌和加热溶化同步进行，节省时间。
3、调pH
在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LnaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直至pH达7.6。反之，用1mol/LHCl进行调节。
4、分装
按照实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角瓶内。
5、加塞
培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口上塞上棉塞（或泡沫塑料塞），以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。
6、包扎
加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。
7、灭菌
将上述培养基以0.，121℃，20min高压蒸汽灭菌。
8、搁置斜面和倒平板
将灭菌的试管培养基冷至50℃左右（以防斜面上冷凝水太多），将试管口端搁在玻棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜，冷凝；倒入平板适当量培养基，冷凝。
9、无菌检查
将灭菌培养基放入37℃的温度中培养24～48h，以检查灭菌是否彻底。
五、思考题
你认为在加热融化琼脂的过程中应注意哪些环节？
实验四微生物的接种和培养
一、实验目的
1、掌握各种接种方法。
2、掌握无菌操作基本环节。
二、基本原理
微生物在自然界中呈混杂状态存在，要获得所需菌种，必需从中把它们分离出来。在保存菌种时不慎受到到污染也需予以分纯。微生物分离和纯化的方法很多，但基本原理却是相似的，即将待分离的样品进行一定的稀释，并使微生物的细胞（或孢子）尽量以分散状态存在，然后使其长成一个个纯种单菌落。然而上述工作又离不开接种，即将一种微生物移到另一灭过菌的培养基上的过程。
三、器材
1、恒温培养箱。
2、接种环、玻璃棒、吸管、酒精灯。
3、培养基（上次实验配制的）。
4、大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌。
四、操作步骤
1、斜面接种（接金黄葡萄球菌）
（1）操作前，先用75%酒精擦手，待酒精挥发后点燃酒精灯。
（2）将菌种管和斜面握在左手大姆指和其它四指之间，使斜面和有菌种的一面向上，并处于水平位置。
（3）先将菌种和斜面的棉塞旋转一下，以便接种时便于拔出。
（4）左手拿接种环（如握钢笔一样），以火焰上先将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管其余部位也过火灭菌。
（5）用右手的无名指、小指和手掌将菌种管和待接斜面试管的棉花塞或试管帽同时拔出，然后让试管口缓缓过火灭菌（切勿烧过烫）。
（6）将灼烧过的接种环伸入菌种管内，接种环在试管内壁或未长菌苔的培养基上接触一下，让其充分冷却，然后轻轻刮取少许菌苔，再从菌种管内抽出接种环。
（7）迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。从斜面底部向上作“Z”形来回密集划线。有时也可用接种针仅在培养基的中央拉一条线来作斜面接种，以便观察菌种的生长特点。
（8）接种完毕后抽出接种环灼烧管口，塞上棉塞。
（9）将接种环烧红灭菌。放下接种环，再将棉花塞旋紧。
2、穿刺接种
把菌种接种到固体深层培养基中，此法用于嫌气性细菌接种或为鉴定细菌时观察生理性能用。
（1）操作方法与上述相同，但所用的接种针应挺直。
（2）将接种针自培养基中心刺入，直刺到接近管底，但勿穿透，然后尚原穿刺途径慢慢拔出。
3、液体接种
（1）由斜面培养基接入液体培养基，此法用于观察细菌的生长特性和生化反应的测定，操作方法与前相同，但使试管口向上斜，以免培养液流出接入菌体后，使接种环和管内壁磨擦几下以利洗下环上菌体。接种后塞好棉塞将试管在手掌中轻轻敲打，使菌体充分分散。
（2）由液体培养基接种液体培养基，菌种是液体时，接处除用接种环外尚用无菌吸管
或滴管。接种时只需在火焰旁拔出棉塞,将管口通过火焰,用无菌吸管吸取菌液注入培养液内,摇匀即可。
五、思考题
（1）接种前和接种后为什么要灼烧接种环？
（2）为什么要接种环冷却后才能用其与菌种接触？是否可以将接种环放在台子上待其冷却？你怎样才能知道它是否已经冷却？
附一无菌操作环节
（1）接种室应保持清洁，用煤粉酚皂液擦洗台面及墙壁，定期用乳酸或甲醛熏蒸。每次使用前，均应用紫外灯灭菌。定期对接种室作无菌程度的检查。
（2）进入接种室前，应先做好个人卫生工作，在缓冲间内要更换工作鞋帽、工作衣、戴口罩。工作衣、工作鞋、口罩只准在接种室内使用。不准穿到其它地方去，并要定期更换、消毒。
（3）接种的试管、三角并瓶等应做好标记，注明培养基、菌种的名称、日期。移入接种室内的所有物品，均须在缓冲室用70%酒精擦试干净。
（4）接种前，双手用70%酒精或新洁尔消毒，操作过程不离开酒精灯火焰；棉塞不乱放；接种工具使用前后均需火焰灭菌。
（5）培养箱应经常清洁消毒。
附二接种室的消毒方法
1、紫外线灭菌
接种室使用前打开紫外灯照射约30分钟，就能使空气和室壁表面基本上无菌。为了加强灭菌效果，在开灯以前可以在接种内喷洒石炭酸溶液，使空气中附有微生物的尘埃降落，并杀死一些微生物。接种室的台面等，可以用2-3%的来苏尔擦洗。
紫外线对人体皮肤，尤其对眼睛具有杀伤力，因皮不要直视开着的紫外灯，也不能在开着灯的情况下工作。
2、喷洒石炭酸
将石炭酸水浴酒精可以少死金黄葡萄球菌吗，稍热，使之溶解。用吸耳球通过吸管吸取该溶液，配成5%溶液。对于小房间，可用喷雾器由上至下、由里至外顺序进行喷雾，并门，稍等片刻即可使用。石炭酸对皮肤有较强的毒害作用，使用时不要接触皮肤。
3、福尔马林熏蒸
（1）用量：市售福尔马林是37-40%的甲醛水溶液。常用量按每立方空间2-6ml计算。
（2）熏蒸方法：用福尔马林熏蒸有两种方法：
①加热熏蒸：按熏蒸空间计算,量取甲醛溶液,放在酒精灯上方的小铁筒或烧杯中,点燃酒精灯,关闭室门。酒精灯最好在甲醛蒸完后即自行熄灭。
②氧化熏蒸：在一瓷杯里铺一张报纸，放入高猛酸钾（其用量为1/2甲醛量），再取定量的甲醛溶液，倒在盛有高猛酸钾的容器里，立即关门。几秒钟后，由高猛酸钾氧化甲醛反应所产生的热将其余的甲醛蒸为气体。
由于甲醛对人眼、鼻有强烈的刺激作用，熏蒸后相当时间内不能进入室内工作。因此，接种室至少在使用前24小时进行熏蒸，房间应密闭，保持12小时。之后可取与甲醛等更是的氨水，倒在一个瓷碗里，放入熏蒸过的接种室酒精可以少死金黄葡萄球菌吗，以减少甲醛对人的刺激作用。用氨水中和，至少应在工作前2小时进行。
4、过滤除菌
近几年来，多采用一种称之为超净工作台的接种室，其原理是借助于一鼓风机将普通空气鼓入，通过粗滤、超滤纤维过滤后，进入工作台内的空气即为无菌空气。整个工作室内要求清洁无尘，这样可延长超净工作台的使用寿命。
新的超净工作台使用前，要进行无菌试验，确定合格方可使用，接种前，应先将工作台开启5-6分钟。
附三接种室无菌程度检查
取无菌的营养琼脂平板，在接种室内台上和台下各放一套，把皿盖打开15min，然后盖好，倒置37℃恒温培养24-28小时，如果每个皿内菌落不超过4个，则可以认为无菌程度良好，若菌落很多，则应对接种室进一步灭菌。
实验五稀释涂布平板菌落计数法
－、目的的要求
学习平板菌落计数的基本原理和方法
二、基本原理
平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单落菌也可能来自样品中的2～3或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。为了清楚地阐述平板落计数的结果，现在已使用菌落形成单位（— units,cfu）而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。
平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因数的影响，但是，由于核计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验（如活菌制剂），以及食品、饮料和水（包括水源水）等的含菌指数或污染程度的检测。
三、器材
1、菌种大肠杆菌菌悬液。
2、培养菌牛肉膏蛋白胨培养基
3、仪器或其他用具1ml无菌吸管，无菌平皿，盛有4.5ml无菌水的试管，试管架，恒温培养箱等。
四、操作步骤
1.编号
取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6各3套。另取6支盛有4.5ml无菌水的试管，依次标是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。
2.稀释
用1ml无菌吸管吸取1ml已充分混匀的大肠杆菌菌悬液（待测样品），精确地放0.5ml 至10-1的试管中，此即为10倍稀释。将多余的菌液放回原菌液中。
将10-1试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混匀。另取一支1ml吸管插入10-1试管中来回吹吸菌悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。吹吸菌液时不要太猛太快，吸时吸管深入管底，吹时离开液面，以免将吸管中的过滤棉花浸湿或使试管内液体外溢。用此吸管吸取10-1菌液1ml，精确地放0.5 ml至10-2试管中，此即为100倍稀释。······其余依次类推。
放菌液时吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接触一个稀释度的菌悬液，否则稀释不精确，结果误差较大。
3.取样涂布平板
用三支1ml无菌吸管分别吸取10-4、10-5和10-6的稀释菌悬液各1ml，对号放入编好号的盛有牛肉膏蛋白胨培养基的无菌平皿中，每个平皿放0.2ml，并尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于实验台上20~30min，使菌液渗入培养基表层内，然后倒置37℃的恒温箱中培养24～48h。
不要用1ml吸管每次只靠吸管尖部吸0.2ml稀释菌液放入平皿中，这样容易加大同一稀释度几个重复平板间的操作误差。
4.计数
培养48 h后，取出培养平板，算出同一稀释度三个平板上的菌落平均数，并按下列公式
进行计算：
每毫升中菌落形成单位（cfu）＝同一稀释度三次重复的平均菌落数×稀释倍数×5 一般选择每个平板上长有30～300个菌落的稀释度计算每毫升的含菌量较为合适。同一稀释度的三个重复对照的菌落数不应相差太大，否则表示实验不精确。实际工作中同一稀释度重复对照平板不能少于三个，这样便于数据统计，减少误差。由10-4、10-5、10-6三个稀释度计算出的每毫升菌液中菌落形成单位数也不应相差太大。
平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释是很重要的。一般以三个连续稀释度中的第二个稀释度倒平板培养后所出现的平均菌落数在50个左右为好，否则要适当增加或减少稀释度加以调整。
五、思考题
计数是否准确和哪些因素有关？
实验六微生物的简单染色和革兰氏染色法
（一）简单染色
一、目的要求
1 学习微生物涂片、染色的基本技术，拿握细菌的简单染色法．
2 初步认识细菌的形态特征。
3 巩固显微镜（油镜）的使用方法和无菌操作技术．
二、基本原理
简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法．此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。
常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱酸性洛液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时．其分子的染色部分带正电荷（酸性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色．经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别．常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等．
当细菌分解搪类产酸使培养基pH 下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色．
三、器材
l.菌种枯草芽孢杆菌12 ~18h 营养琼脂斜面培养物，大肠杆菌约24h 营养琼脂斜面培养物．
2 ．染色剂草酸按结晶紫染液，番红染液．
3 ．仪器或其他用具显微镜．酒精灯，载玻片，接种环等．
四、操作步骤．
1 ．涂片
2 ．干燥
室温自然干燥。
3 ．固定
涂面朝上，通过火焰2 ~ 3 次．此操作过程称热固定，其目的是使细胞质授固，以固定细胞形态，并便之牢固附着在载玻片上．
4 ．染色
将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液于除片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）.
5 ．水洗
倒去染液．用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止，
6 ，干燥
自然干燥，或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸千．
7 ，镜检
涂片干后镜检．
涂片必须完全干燥后才能用油镜观察.
五、思考题
1 ．结果
根据观察结果，绘出两种细菌的形态图．
2 ．思考题
( 1) 你认为制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些环节？
( 2 ）为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察？
( 3 ）如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题？如果加热温度过高、时间太长，又会怎样呢？
（二）革兰氏染色法
一、实验目的
1.学习并初步掌握革兰氏染色法。
2.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
二、基本原理
革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。结晶紫初染后，所有细菌都被染成蓝紫色。碘的媒染，使结晶紫和碘形成复合物，从而增强了燃料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫一碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复然后仍保留初染剂的篮紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫一碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂后，细胞被染上复染剂的红色。
三、器材
1、菌种大肠杆菌约24h 营养琼脂斜面培养物，枯草芽孢杆菌约24h营养琼脂斜面培养物。
2、染色体革兰氏染色液。
3、仪器和其他用具
四、操作步骤
1、制片
取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。
要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色；涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性；火焰固定不宜过热（以玻片不烫手为宜）。
2、初染
滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色1～2min，水洗。
3、媒染
用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min水洗。
4、脱色
用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95％的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。
革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节，脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌，脱色时间一般约20~30s。
5、复染
用番红液复染约2min,水洗。
6、镜检
干燥后，用油镜观察。
菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色的为革兰氏阴性菌。
五、思考题
（1）、你认为那些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？如果影响，请简述其中最关节的环节是什麽？
